PRECIPITACIÓN CON METANOL-CLOROFORMO
1. Muestra (1 volumen).
2. Añadir 4 volúmenes de metanol.
3. Agitar bien.
4. Añadir 1 volumen de cloroformo.
5. Agitar.
6. Añadir 3 volúmenes de H2O.
7. Agitar.
8. Centrifugar 1 min a 14.000 g.
9. Retirar la capa acuosa superior (las proteínas están entre las dos capas).
10. Añadir 4 volúmenes de metanol.
11. Agitar.
12. Centrifugar 2 min a 14.000 g.
13. Retirar tanto metanol como sea posible sin remover el sedimento.
14. Secar en centrífuga de vacío.
Resuspender en tampón de muestra para SDS-PAGE
Referencias
Concentración and eliminación de detergentes
Sauve, D. M., D. T. Ho, et al. (1995). "Concentration of dilute protein for gel electrophoresis." Anal Biochem 226(2): 382-3.
Wessel, D. and U.I. Flugge (1984). "A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids." Anal Biochem 138(1): 141-3.
PRECIPITACIÓN CON TCA
1. Diluir proteína hasta 500 ul con agua en un tubo eppendorf.
2. Añadir:
o 50 ul de DOC
o 25 ul de TX 100
o 80 ulde TCA (TCA 13 %)
3. Dejar por lo menos 2 h en hielo.
4. Centrifugar en una microcentrífuga a 4º C durante 30 min a máxima velocidad (15.000 rpm).
5. Se formará un sedimento escamoso en los laterales del tubo.
6. Vaciar, dejar el tubo en un papel para retirar la mayoría del líquido.
7. Añadir 500 ml de etanol/eter (acetona fría) . Sonicar en un baño para disgregar el sedimento.
8. Poner en hielo durante 30 min.
9. Repetir paso 4.
10. Quedará un depósito pequeño o nada.
11. Repetir paso 6.
12. Dejar secar con el aire a temperatura ambiente.
13. Resuspender las muestras en 5 ml de “running buffer” primero, después 20 ml de “sample buffer”.
14. Calentar a 85º C durante 5 min.
15. Cargar muestra a cada pocillo (25ml).
Referencias
Concentración and eliminación de detergentes
Sauve, D. M., D. T. Ho, et al. (1995). "Concentration of dilute protein for gel electrophoresis." Anal Biochem 226(2): 382-3.
Wessel, D. and U.I. Flugge (1984). "A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids." Anal Biochem 138(1): 141-3.
Precipitación de proteínas con TCA
Brown, R. E., K. L. Jarvis, et al. (1989). "Protein measurement using bicinchoninic acid: elimination of interfering substances." Anal Biochem 180(1): 136-9.